E200paul.com

Western Blot ohjeet

Western Blot ohjeet

Western blot analyysi on tunnettu tekniikka tunnistaa erityiset proteiinit eristetty kudosta. Eri proteiineja ensin ilmaiseksi ja paino SDS-Polyakryyliamidigeeli ja siirretään nitroselluloosa-kalvo. Siirron merkitty vasta sitomista erityisesti haluttu proteiini ja on kuvannut käyttäen Röntgenkuvien tai visualisoidaan proteiini-spesifisen. Lopputulos näyttää tumma bändejä on tunnistettu proteiinia. Tässä artikkelissa keskitytään perusmenetelmien Western blot analysoimista laboratoriossa kelpuutettu monimutkainen proteiini.

Ohjeet

Siirtää proteiineja nitroselluloosa kalvo

• Valmistaa nitroselluloosa-kalvo. Kalvo liottaa tislatussa vedessä kaksi minuuttia, sitten sijoitettu siirto puskuriin ja annetaan liota viisi minuuttia.

• Koota siirto voileivän koostuu sieni/suodatinpaperin/käyttöturvallisuustiedote sivu/nitroselluloosa kalvosuodatin/paperi/sieni. Sandwich tasataan joten kalvo on lähempänä anodi ja geeli lähemmäksi katodi siirto kammiossa.

• Lisätä siirto puskurin istuntosalissa, joten sandwich on veden alla. Paikka kammion sisällä laboratorio-jääkaappi. Kuljetus proteiinin geeli kalvo olisi tehtävä 4 astetta.

• Määrittää virtalähde siirtää proteiineja geelin päälle kalvo. Siirron suunta on kohti anodi merkitty punainen johto. Suurempi proteiinien siirtää lisää nopeasti vastauksena sähkövirran ja tekee ensimmäisen siirron. Virtalähde ohjaa määrä siirtää. Asettaa valtaa 30 V ja 40 mA yön siirtoa.

• Pura virtalähde, kun siirto on valmis. Ei tehdä, ota siirto puskurista tai poista voileipä, kun virtalähde on liitetty.

• Irrota kalvo sandwich ja inkuboidaan kahden tunnin estää ratkaisu. Estää liuoksen proteiinien imee osaksi kalvo, jossa ei ole proteiineja läsnä. Se estää sitova vasta-aineita, missä ei ole haluttu proteiini kalvoon.

Sitova vasta

• Inkuboidaan nitroselluloosa kalvo ensisijainen vasta ratkaisun agitaattori. Kalvo on kokonaan upoksissa liuoksessa vähintään tunnin. On hyväksyttävää inkuboidaan.

• Pese kalvo perusteellisesti poistaa ei-sidotun vasta. Neljä erillistä 10 minuutin pesee TBS riittävät yleensä poistaa ylimääräinen vasta.

• Inkuboidaan merkitty vasta konjugaatin liuos kohteleva agitaattori kalvo. Kalvo on inkuboitava ainakin tunnin. Merkitty vasta-aine-konjugaatti on sidottu alkalisen. Se on entsyymi-vasta-sekoitus, joka tunnistaa ja sitoa ensimmäisen vasta.

Etsivä-lta proteiini

• Huuhtele kalvo 10 minuuttia PBS neljä kertaa. Tämä poistaa loput merkitty vasta-aine-konjugaatti.

• Inkuboidaan kalvo Emäksinen fosfataasisubstraattiliuos, kunnes yhtye mallit näkyvät. Väriaine alustalle ratkaisun sitoa vasta antigeenin proteiinia kalvo ja tumma Manowar. Prosessi voidaan välittömästi tai vaatia jopa 30 minuuttia bändit noudatetaan.

• Kääri kalvo täysin sellofaaniin ja laita se suoraan geeli-imager visualisoida tuloksia. Geeli imager pystyy valokuvaus tulokset näytetään Western blot-kalvo.